1、项目简介

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)被广泛用于食品工业生产，是一种安全性很高的工业菌株；具有包括Sec 和Tat 分泌途径在内完善的蛋白分泌系统；没有类似于大肠杆菌(E. coli)所带来的内毒素和宿主细胞蛋白污染等问题（表1）。这些显著优点使它成为一种有吸引力的外源蛋白表达生产用的底盘细胞。目前国内生物医药领域主要依赖于E.coli 表达体系生产医药蛋白，原创性外源蛋白表达体系的缺失，在知识产权方面将制约到我国生物医药产业的发展。该项成果有望为我国生物医药产业提供一个具有自主知识产权的谷氨酸棒杆菌安全高效外源蛋白表达体系。

特别是2020年国家推出全面禁止在动物饲料中添加抗生素的政策，极大增加了我国畜牧业对兽用细菌疫苗的需求。兽用疫苗中，利用细菌表达系统生产的基因工程疫苗因交叉免疫效果好在预防禽畜疫病方面具有广阔应用前景。利用C. glutamicum表达系统生产兽用疫苗蛋白，可以降低内毒素，强化可溶性表达，简化下游蛋白分离纯化过程，表现出了显著的过程集成效应。（图1）。通过近年来团队的不断努力，我们初步开发的基于谷氨酸棒杆菌的可溶性高效蛋白表达体系已成功地解决了多家医药企业的生产过程技术与知识产权问题，比如目前利用谷氨酸棒杆菌宿主所构建的猪胸膜肺炎疫苗蛋白Omp、脑钠肽BNP、前胶原肽PINP分泌表达工程菌株均已具备工业应用潜力。

2、创新要点

该项目利用先进的合成生物学、分子生物学以及高通量培养筛选系统，创制了具有自主知识产权的谷氨酸棒杆菌安全高效外源蛋白表达体系，处于国际先进水平。

技术上创新：本项目开发了适合谷氨酸棒杆菌重组蛋白表达的元器件、基因编辑工具以及高效的底盘细胞。具体包括双顺反子表达结构、高效的组成型和诱导型启动子、能够正确引导重组蛋白分泌的高效信号肽以及适用于C.glutamicum 的CRIPSR-Cas9 基因编辑工具，并将其应用到宿主细胞的改造中。在底盘细胞改造方面，基于改造底盘细胞代谢流趋向于重组蛋白表达有利方向的研究思路，通过转录组、多变元分析等方法寻找改造底盘细胞的遗传位点，构建了显著提高重组蛋白表达的一系列突变体菌株。

    结果上创新：目前国内外药用蛋白的表达生产主要依赖于大肠杆菌表达体系，形成了系列化专利壁垒，而我国在原创性外源蛋白表达体系研究领域的落后和菌株知识产权的缺乏，已经呈现出制约到我国生物医药产业健康发展的态势。本项目以具有自由知识产权出发菌株为基础，基于系统的细胞工厂创制技术体系，能够从源头上规避许多已有的基于已知生物学“知识”的基因工程和代谢工程手段所形成的专利壁垒，为我国药用蛋白的生产提供了一种高效自主的微生物表达体系。